植物組織培養及其在中草藥研究中的運用

植物組織培養(Plant  Tissue  Culture)是應用無菌培養的方法培養植物的一個離體部分,也即是一種將自然環境中分離出來的植物細胞或組織放入含有合成培養基的瓶中,在無菌條件下使之生長或發育的方法。這項工作自動控制50年代後期至今巳取得了很大的進展,如誘導培養胡蘿蔔的體細胞分化成完整植株,由曼陀羅的花藥培養形成了單倍體的植株。

從而證明了植物每個體細胞都有形成整體植物的潛在能力,如植物細胞具有「全能性」,在離體培養的一定條件下能誘導其分化器官和再生成植株。70年代以後有關植物原生質體培養和體細胞雜交的研究得到了很訣發展,如煙草、曼陀羅、顛茄、胡蘿蔔、油菜等能從其原生質體經培養再生分化長成胚或完整的植物,利用原生質體融合已經能使煙草屬和矮牽牛屬的雜種細胞增殖分化成雜種植株。

因此,運用組織培養方法可以在比較簡單易觀察的條件下研究細胞、組織或器官的繁殖、生長和分化,以及各種外界因素對它們的影響,從而為解決農業生產和藥物生產中的某些問題開闢了廣闊的前景,目前已有若干重要成果應用於生產實踐中,一為營養繁殖系的快速繁殖,如以甘蔗為例,原來每畝要用蔗種0.5~1噸,用組織培養快速繁殖的幼苗進行栽培可節省大量蔗種。又如貝母繁殖率非常低,而用組織培養分化出的三個月左右的鱗莖,其大小就相當於用種子繁殖二年生的鱗莖,另一為藥物和生物製品的工業生產,藥用植物的有效成分一般都從植物體提得,其產量和質量難免要受到植物的遺傳性、生長條件、收穫時間及貯藏和運輸等因素所影響,如果能採用類似培養微生物產生抗菌素的方法生產有效成分,就可克服這些缺點,這對生長條件要求嚴格、生長緩慢、產量低、價值貴重的植物藥更有意義。如近年來已大量培養人參組織,並提取有效成分,因此利用組織培養生產藥用成分,探索天然藥物生產工業化的途徑是當前藥物生產的一個新方向,隨著大規模人工培養技術的成功,就有可能用組織培養法來代替全植物提取有效成分,這項工作將是未來研究植物藥的中心課題之一。

一、培養基的組成和配製法

近年來用的化學合成培養基大致由6種成分組成:(1)糖類,2多種無機鹽類,(3)微量元素,(4)氨基酸、酰胺、嘌呤:(5)維生素;3生長素。此外,有些培養基還可添加天然的汁液,如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麥芽浸出液等,培養基中如加入0.5~1%的瓊脂即為靜止培養的固體培養基,否則為懸浮培養的液體培養基。不同植物材料常需要改變配方,如維持生長和誘導細胞分裂和分化的培養基配方就不同,因此配方的種類很多,目前以Ms  (Murashige  and  Skoog)培養基配方為最常用的一種基本培養基,它利於一般植物組織和細胞的快速生長。

總之,在進行組織培養研究時應根據研究目的和培養植物的種類來確定培養基的組成,除營養、誘導作用外還應當注意離子平衡和毒性問題,如水一般都採用重蒸餾水,無機鹽類一般都需用化學純的藥品,  pH值可用1N  KoH(或NaOH)溶液和2N  HCI調整。有時可以用普通藥品代替,但須注意這些藥品不僅應有營養價值,還須無毒。如果在工業上使用大缸深層培養細胞或組織生產有效成分和生物製品、應用培養基的量將要以噸位計量時,則採用什麼代用品較為經濟實用更應慎重考慮。

二、培養條件

(一)溫度: 對大多數植物組織20~28℃即可滿足生長所需,其中26~27℃最適合。

(二)光: 組織培養通常在散射光線下進行。光的影響可導致不同的結果。有些植物組織在暗處生長較好,而另一些植物組織在光亮處生長較好,但由愈傷組織分化成器官時,則每日必須要有一定時間的光照才能形成芽和根。有些次生物質的形成,光是決定三因素。

(三)滲透壓: 滲透壓對植物組織的生長和分化很有關係。在培養基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質可以調整滲透壓。通常1~2個大氣壓可促進植物組織生長,2個大氣壓以上時,出現生長障礙,6個大氣壓時植物組織即無法生存。

(四)酸鹼度: 一般植物組織生長的最適宜pH為5~6.5。在培養過程中pH可發生變化,加進磷酸氫鹽或二氫鹽,可起穩定作用。

(五)通氣: 懸浮培養中細胞的旺盛生長必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養時巨常轉動或振蕩,可起通氣和攪拌作用。大量培養中可採用專門的通氣和攪拌裝置。

三、材料和方法

從低等的藻類到苔蘚、蕨類、種子植物等高等植物的各類、各部分都可採用作為組織培養的材料,一般裸子植物多採用幼苗、芽、韌皮部細胞,被子植物採用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠等各個部分。

由於植物在自然條件下,表面常被黴菌和細菌污染,故材料必須進行滅菌處理。一般用漂白粉溶液(1~10%)、次氯酸鈉溶液(0.5~10%)、昇汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或過氧化氫(3~10%)等處理後,再用無菌水反覆沖洗至淨,然後在無菌室內,將所取的組織迅速培養在固體培養基上。在適宜的條件下,受傷組織切口表面不久即能長出一種脫分化的組織堆塊,稱為愈傷組織(Callus),此種愈傷組織在適當的培養基上經一定時間即能誘導生長成整株植物,因此愈傷組織既可是某種植物代謝產物的來源,又是誘導成株的主要途徑之一。

在適宜的培養條件下,還可使愈傷組織長期傳代生存下去,這種培養稱為繼代培養。但在繼代培養中,不少植物培養的組織或細胞隨著再培養代數的增加,分化能力就逐漸降低甚至喪失,其原因可能是由於在培養過程中原有母體中存在的、與器官形成有關的特殊物質被逐漸消耗所致,因此可以用激素或改善營養條件使之恢復,也有認為是組織和細胞在長期培養中遺傳往的改變,主要是染色體的變化,出現大量多倍性或非整倍性細胞,這種改變恢復的可能住較小。不同的培養基可以使愈傷組織具有不同的生長速度,結構也可松可緊,利用這些特性可使之分散成為單細胞或很小的細胞團。要形成單細胞培養宜在較高鹽分、高生長素及高水解酪蛋白的培養基中進行,然後移入液體並經攪拌而分散成單細胞。也有用加入一些果膠酶的辦法,但一般來說要得到純一的單細胞是很少的。

在培養藥用植物選材時,還應考慮到所需要的次生物質在植物體中的合成部位,如果選材和培養方法適當,可使原植物內所產主的代謝物通過細胞或組織培養發生生化轉變而獲得。

通過組織培養可獲得有效成分,但實際上只有大量培養成功才有經濟價值。因此在生產上常採用懸浮培養法來代替含有瓊脂的固體培養基。愈傷組織懸浮培養的生長通常比靜止培養快,這是由於懸浮培養時營養成分可較快地滲入細胞,抑制生長的代謝廢物可較快地除去,同時供氧情況也較好,在進行這種培養時要注意通氣與定期更新營養液,這是保證生長穩定,次生物質產量高的關鍵之一。

四、有效成分的形成

列舉用組織培養方法合成的一些有效成分。

利用組織培養方法產生藥用成分,已漸漸成為藥物生產的新方向之一。六十年代以來,有些國家已經開展了薯蕷及其他有關科屬植物的組織培養,研究薯蕷皂甙元的形成,探討其生物合成機制;已知有7種薯蕷屬植物經組織培養後,可獲得薯蕷皂甙元或其它甾體化合物,其中三角葉薯蕷Dioscorea  deltoides  Wal1。經組織培養得到薯蕷皂甙元的含量為0.3~2.5%,此外尚有魚籐酮、甘草甜素,菸鹼等,例如從煙草根尖細胞懸浮培養可產生2.9%(干重)菸鹼。

在通常應用的基本培養基中適當添加生長激素、維生素或其他化學藥品有時能使代謝物增加,如白花曼陀羅組織培養時,在培養基中加進0.1%酪氨酸可使阿托品的產量增加7倍多,芸香組織培養時在培養基中添加4一羥基-2奎林酚,可促進白蘚鹼的合成和積累,在這兩例中的添加物被認為是生物合成的前體。又如培養三分三愈傷組織時,在生長後期供給1my/1激動素,可使東莨菪鹼的含量達到0.495%,比原植物中的含量提高很多。

除了培養基的組成外,環境因素也影響次生物質的產生。例如石芹的組織培養在黑暗中雖也增殖,但不形成黃酮類,而當暴露於光線中時,就能測出芹菜甙。組織培養應用在藥學方面的工作雖然歷史不長,但發展很迅速,它具有如下一些優點:

1.利用組織培養代替原植物的栽培以獲得所需的有效成分,達到產量高,成本低的目的,還可節約土地。

2.除了應用於產生次生物質外,還可應用於生物轉化。例如煙草組織培養中蒂巴因去甲基後可能生成嗎啡。

3.從組織培養的定性分析中發現新化合物。例如在芸香組織培養中,合成和積累了芸香素(Rutacultin),它是一個至今尚未能從原植物或其他植物的夫喃香豆精中檢測到的化合物。因而,組織培養將是獲得新的生物活性化合物的一個來源。

4.一般情況下,組織培養是異養的,但也有自養的細胞系株,它們具有光合作用的能力而不依賴外界的糖類供應。這種特性將使細胞培養技術優越於全植物,並更為經濟。

目前中國有關單位已成功地將麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌進行工業化生產,高等植物組織培養在工業化中的應用也正在研究。

總之,植物組織培養這一新技術在中草藥方面應用的前途是無限廣闊的,它不僅有利於探討和闡明藥用植物生理、遺傳和成分生物合成等一系列理論問題,而且一旦工業化生產問題得到解決,將可以為防病治病做出很大的貢獻。


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